Chapter 1      Introduction                                                                                                   1

1.1  Problem statement                                                                                         1

1.2  Introduction                                                                                                    1

Chapter 2      Literature review                                                                                         4

   2.1 Introduction to literature review                                                                    4

              2.2 Microbial degradation of petroleum hydrocarbon                                       5

            2.3 Factors that affect biodegradation of Petroleum Hydrocarbon       5

                  2.3.1 Chemistry of petroleum oil                                                                        6

                  2.3.2 Temperature                                                                                                 7

                2.3.3 Nutrients                                                                               8

                  2.3.4 Soil characteristics                                                                                      9

                         2.3.4.1 Moisture                                                                                              9

                         2.3.4.2 Oxygen                                                                                             10

                   2.3.5 Concentration of petroleum hydrocarbon                                          10

                   2.3.6 Bioavailability                                                                                          11

             2.4 Mechanism of Petroleum hydrocarbon degradation            13

                 2.4.1 Enzymes Participating in Degradation of Hydrocarbons       13

                 2.4.2 Strategy employed by microorganisms in uptake

                         of Hydrocarbons by Biosurfactants                                      14

             2.5. Biological pathway exploited by microorganisms 

                    during petroleum degradation                                                   15

               2.6 Negative effect of petroleum hydrocarbons 

                     in the environment                                                                                         17

                 2.6.1 Effect on human and animals                                                                17

                 2.6.2 Effect on plants                                                                                         17

                   2.6.3 Effect on water and marine life                                                19

               2.7 Xenobiotics                                                                                 20

               2.8 Bioremediation                                                                                               21

                   2.8.1 Bioaugmentation                                                                                     22

                     2.8.2 Biostimulation                                                                                         22

               2.9 Soil microbiology                                                                                            22

               2.10 Isolation and characterisation techniques                                              22

                       of microorganisms                                                                                        23

                   2.10.1 Isolation                                                                                      23

                    2.10.2 Characteristics                                                                          23

Chapter 3 Materials and methods                                                                                     26

3.1 Introduction to Materials and methods                                                          26

3.2 Source of sample                                                                                               26                                               

3.3 Sampling                                                                                                             26

3.4 Plate count method                                                                               27

3.5 Characterisation                                                                                                 27     

3.5.1 Preliminary identification of isolated bacteria                                                 27

3.5.2 Gram staining                                                                                             27

3.5.3 Cell morphology                                                                                         28

3.5.4 API test                                                                                                        28

Chapter 4 Results                                                                                                                 32

  4.1 Introduction to Results                                                                                    32

  4.2 Isolation                                                                                                             32

             4.3 Cells counts and characterization of bacterial isolates                   32

4.4 Biochemical test                                                                                              33

Chapter V Discussion                                                                                                         35

5.1   Introduction to discussion                                                                            35

5.2  Discussion                                                                                                      35

5.3 Conclusion                                                                                                       40      

References                                                                                                                            41

Appendix A                                                                                                                            55

Appendix B                                                                                                                            57

Appendix C                                                                                                                            60

Tables                                                                                                                       page 

Table 2.1 Enzymes involved in the degradation of                               

                petroleum hydrocarbons                                                               14

Table 3.1 API 20E tests with their corresponding

                numerical value                                                                                          29

Table 3.2 Chemical / Physical Principles – Basis 

                for the API 20E System                                                                              29

Table 3.3 API 20NE tests with their corresponding

                numerical value                                                                                         30

Table 3.4 Chemical / Physical Principles – Basis                                                

                for the API 20NE System                                                                           30

Table 4.1 Bacteria plate count of the original samples                                        31

Table 4.2 Characteristics of the bacteria isolates                                                  33

Table 4.3 API 20E results                                                                                          34

Table 4.4 API 20NE results                                                                                       34

List of figures

Figures                                                                                                                      page                                                 

Figure 2.1 Molecular structures of hydrocarbons                                                   6

Figure 2.2 General pathway of oxygen degradation of petroleum                       

 hydrocarbon by microorganism                                                                                 13

Figure 2.3 Enzymatic reaction involved in aerobic petroleum 

hydrocarbon degradation                                                                                             16

Figure 4.1 Isolates after 72 hours                                                                               32

Figure 4.2 Nutrient broth after 48 hours of incubation                                           33

Figure 6 API result sheets                                                                                             59

List of abbreviations

PAH                            Polycyclic Aromatic Hydrocarbon

DCPIP                        Dichlorophenolindophenol 

US EPA                     United States Environment Protection Agency 

PCR                           Polymerase Chain Reaction 

16S rRNA                  16 Svedberg ribosomal ribonucleic acid

NA                              Nutrient Agar

NB                              Nutrient Broth

API                              Analytical Profile Index

CFU                            Colony Forming Unit

cm                               centimetre

DNA                           Deoxyribonucleic Acid

g                                  gram

°C                                Degree Celsius 

Petroleum contaminated soil samples were collected and investigated for the presence of bacteria that can biodegrade petroleum hydrocarbons. The samples were collected from a car repair garage from the surface and at 5 cm down the surface. Both samples showed growth on Nutrient agar (NA) and Nutrient Broth (NB) supplemented with Diesel and Gasoline oils as sole carbon source. However, the surface samples had more growth compared to the 5 cm sample. Isolated strain X1, X2 and X3, were found Gram’s negative. X1 was rod and X2 and X3 were coccobacilli type. API 20E and API 20NE identified Three potent bacteria strains capable of degrading hydrocarbons from the genera Mannheimia haemolytica (X1), Sphingomonas paucimobilis (X2) and Brevundimonas vesicularis (X3). M. haemolytica had the highest growth and shortest lag phase compared to S. paucimobilis and B. vesicularis.